抗體選擇和稀釋

對于任何一種給定的目標抗原，都有不止一種有效抗體。為了縮小選擇范圍，實驗中通常要考慮以下幾個方面：

1、分析或者應用類型

2、樣品的性質

3、樣品的種類

4、抗體宿主的中落淚

5、抗體的標記和檢測

樣品的性質：根據樣品的性質選擇合適的抗體至少要考慮以下幾個方面

1、要檢測的蛋白區域。刺激宿主動物產生抗體的抗原物質種類繁多，包括全長的蛋白、蛋白片段、多肽、整個生物機體（例如細菌）或細胞。免疫原通常在說明書中會有顯示（但有一些情況抗原是資料，不能公開）。如果要檢測的是一個蛋白片段或全長蛋白的異構體或特定區域，應該選擇由該特異片段或區域或者包含該特異片段或區域所制備的抗體。如果要通過FACS去檢測活細胞表面蛋白，則要選擇由胞外區蛋白抗原制備的抗體。

2、樣品的處理工藝。有些抗體要求樣品先進行特殊處理。例如，許多抗體只識別降解或變性蛋白，可能因為這樣可 暴露藏在二次或三次折疊后蛋白內部的抗原表位。另一方面，有些抗體卻只能識別自然折疊狀態蛋白上的表位。（Abcam公司用于western blotting的抗體，樣品都需進行降解和變性處理，除非在說明書中特別標明）。當搜尋用于免疫組化的抗體時，則應注意有些抗體只適合用于未固定冷凍組織。有時，抗原修復步驟則*，這樣可以消除由福爾馬林固定所引起的交聯，因為有些抗體不能結合福爾馬林固定和石蠟包埋組織中的目標抗原。上述限制會在說明書的應用章節中明確標出。

樣品的種類

盡管由于具有足夠多的同源氨基酸序列，抗體有可能和其它物種的同一靶蛋白反應，但是我們選擇抗體時仍然應該選擇來源于同一物種的抗原。如果樣品不是來自于列表所示的物種之一，不能說明該抗體不可以用來檢測這種樣品，但是來自該物種的樣品未被檢測過，因此我們很難推薦它的適用性。根據序列相似性可以預測交叉反應性，值得驕傲的是Abcam在說明書里有ExPASy和NCBI  BLAST的鏈接，可以比對不同物種來源氨基酸序列的同源性。

選擇一抗宿主的類別

一般來說，當用標記二抗來檢測非標記一抗時，產生一抗的宿主動物的類別就非常重要。對于免疫組化，產生一抗的宿主應盡可能和樣品的宿主種類不同，以避免二抗的免疫球蛋白與樣品中內在的免疫球蛋白發生潛在的交叉反應。例如，用于檢測鼠源蛋白的一抗就不應來源于小鼠或大鼠，選用來源于兔的一抗和抗兔的標記lgG二抗進行檢測，會比較合適。如一抗已直接附有標記，則可避免上述交叉反應發生。對于不含內源性免疫球蛋白樣品的檢測，宿主的種類選擇不用很嚴格。例如進行western blotting的細胞裂解液就被認為不包含lgG會以50和25kDa的條帶出現在在降解和變性樣品中，分別相當于lgG分子的重鏈和輕鏈。

選擇二抗

二抗應來源于一抗的物種。舉例來說，如果您的一抗來源于鼠，那么二抗也就應該選擇抗鼠的。我們建議仔細核對二抗說明書以確定您要使用的二抗經過測試可用于您的實驗。Abcam提供有大量標記各種熒光物質和染色物質的二抗。檢查您所用的一抗數據表的底部，將會顯示一些合適的二抗。

雙重染色體的選擇

對培養細胞或組織進行雙免疫染色要求非標記一抗來源于不同物種的動物，而二抗則特異性識別其中一種一抗。二抗如果與其它動物來源的免疫球蛋白有交叉吸附，則會再說明書中明確說明。

熒光和染料標簽：標簽抗體的目的是要看到抗體結合的信息。標簽的選擇依據以下幾個方面

1、檢測方法：英冠或有色沉淀。英冠標簽會再特定波長的光激發下發光。有多重熒光可供選用，不同熒光標簽有*的吸收和激發波長。在結合了合適的底物時，酶標簽HRP和AP可以形成有色沉淀。

2、封固劑（只限免疫組化）：AEC、Fast Red、INT或是其它的水溶性染色劑均溶于酒精，因此要求使用水溶性封固劑。一上提到的其它有機物要想得到較好的折射率，使用有機封固劑封固。熒光素標簽需要水溶性封固劑。膽藻素蛋白（藻青蛋白/藻紅蛋白）需要不加甘油的水溶性封固劑，否則會產生淬滅效應。

3、生物素標記的抗體對于信號的放大是很有效的，比如可應用于親和素-生物素-酶或熒光復合物（通常縮寫為ABC試劑）或者親和素或鏈霉親和素結合酶或熒光染料檢測法。

未純化抗體的稀釋和濃縮

未純化抗體中的目標抗體濃度有很大的差異。如果不清楚未純化抗體樣品的濃度，就可以參考下面的“特殊范圍”作為估計的指導。